GB/T 5750.12-2023《生活饮用水标准检验方法 第12部分：微生物指标》全文与要点

标准概况

GB/T 5750.12-2023《生活饮用水标准检验方法 第12部分：微生物指标》是中华人民共和国国家标准，由国家市场监督管理总局、国家标准化管理委员会于2023年3月17日发布、2023年10月1日实施，代替GB/T 5750.12-2006《生活饮用水标准检验方法 微生物指标》，由国家卫生健康委员会提出并归口，历次版本：1985年首次发布为GB/T 5750-1985，2006年第一次修订为GB/T 5750.12-2006，本次为第二次修订；与2006版相比主要增加了6个检验方法。

标准定位

GB/T 5750《生活饮用水标准检验方法》作为生活饮用水检验技术的推荐性国家标准，与GB 5749《生活饮用水卫生标准》配套，是GB 5749的重要技术支撑，为贯彻实施GB 5749、开展生活饮用水卫生安全性评价提供检验方法。本部分（第12部分）专门规定微生物指标的检验方法——微生物指标（菌落总数、总大肠菌群、大肠埃希氏菌、贾第鞭毛虫、隐孢子虫等）是饮用水卫生安全的核心指标（肠道致病菌经饮用水传播引起介水传染病，微生物污染是饮水安全的第一风险），本文件为GB 5749规定的微生物指标限量检验提供标准方法（GB 5749规定总大肠菌群不得检出、大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群不得检出等）。

检验方法体系

菌落总数的测定。 平皿计数法：水样经适当稀释后取1mL注入平皿，倾注营养琼脂培养基，36℃±1℃培养24h-48h，计数平皿上长出的菌落总数——反映水样中可培养的异养细菌总量（消毒效果和水质卫生学评价的通用指标）。
总大肠菌群的测定。 多管发酵法（最可能数MPN法）：按不同稀释度接种乳糖蛋白胨培养液多管（如5管法、10管法），36℃±1℃培养24h-48h，产酸产气者为阳性管，查MPN表求总大肠菌群数；滤膜法：水样经孔径0.45μm滤膜过滤截留细菌，滤膜贴在选择性培养基（品红亚硫酸钠培养基等）上培养，计数典型菌落（大肠菌群特征菌落——紫红色带金属光泽）——"多管发酵法定性定量+滤膜法直接计数"两种方法按实验室条件选用。
耐热大肠菌群（粪大肠菌群）的测定。 44.5℃±0.5℃培养温度下能生长的总大肠菌群（反映粪便近期污染）：多管发酵法（44.5℃培养产酸产气）、滤膜法（44.5℃培养计数）——耐热大肠菌群比总大肠菌群更直接指示粪便污染。
大肠埃希氏菌的测定。 多管发酵法、滤膜法、酶底物法：大肠埃希氏菌能产生β-葡萄糖醛酸酶（与底物反应显色/荧光）、靛基质试验阳性等特征加以鉴别；酶底物法（Colilert等）：水样与含底物的培养基混合，36℃培养24h，总大肠菌群产生黄色、大肠埃希氏菌产生荧光——"酶底物法一步同时检出总大肠菌群和大肠埃希氏菌"是现代快速定量方法（MPN计数）。
贾第鞭毛虫和隐孢子虫的测定（新增方法）。 免疫磁分离-免疫荧光法：水样经淘洗浓缩（淘洗缓冲液——月桂醇聚醚-12、Tris、EDTA、止泡剂配制，从滤膜上洗脱截留的包囊和卵囊）、密度梯度分离（除去杂质）、免疫磁分离（抗隐孢子虫单克隆抗体磁微粒和抗贾第鞭毛虫单克隆抗体磁微粒捕获目标包囊卵囊——磁微粒上的抗体与贾第鞭毛虫包囊和隐孢子虫卵囊特异性结合，磁分离架分离富集）、免疫荧光染色（抗隐孢子虫/贾第鞭毛虫单克隆抗体-异硫氰酸盐荧光素试剂盒染色）、荧光显微镜鉴定计数——贾第鞭毛虫和隐孢子虫（“两虫”）是饮用水原虫性病原体（隐孢子虫卵囊对氯消毒抵抗力强，常规氯消毒不能有效灭活，是介水原虫病的病原，GB 5749规定贾第鞭毛虫和隐孢子虫限值（如<1个/10L），本方法为“两虫”监测提供标准方法——方法路线与USEPA 1623方法一致（淘洗浓缩+免疫磁分离+免疫荧光）。
产气荚膜梭状芽孢杆菌的测定（新增方法）。 在选择性培养基（如亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶培养基）上厌氧培养（或铁亚硫酸盐培养基），产气荚膜梭状芽孢杆菌产生黑色菌落——产气荚膜梭菌是"消毒指示菌"（芽孢对消毒剂抵抗力强于大肠菌群，其存在提示消毒处理不彻底或原虫等抗性病原体可能存活）。
质量控制。 培养基检验：更换不同批次培养基时要进行阳性和阴性菌株检验——阳性菌株产气荚膜梭状芽孢杆菌（标准菌株CICC 22949或其他等效标准菌株）和阴性菌株生孢梭菌（标准菌株CICC 10385或其他等效标准菌株）制成5CFU/100mL-100CFU/100mL的菌悬液，按试验步骤操作，阳性菌株应产生黑色菌落、阴性菌株不应产生黑色菌落；其他培养基和试剂采用阳性菌株进行验收。对照试验：定期进行阳性及阴性对照试验（阳性菌株产气荚膜梭状芽孢杆菌、阴性菌株生孢梭菌，按试验步骤操作），阴性对照不应出现黑色菌落、阳性对照应产生黑色菌落再经确认检出产气荚膜梭状芽孢杆菌；若阴性对照或阳性对照试验结果不符合，本批次试验结果无效，应查明原因后重新测定——"菌株检验+阴阳对照"保证培养基质量和试验结果可靠。

知识点总结

"菌落总数-指示菌-病原体"的三级微生物指标体系。 饮用水微生物检验是三级体系：菌落总数（卫生学总指标——反映消毒效果和细菌总体水平）、大肠菌群类指示菌（总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌——指示粪便污染和肠道病原体存在的可能性，大肠埃希氏菌是粪便污染的专一指示菌）、特定病原体（贾第鞭毛虫、隐孢子虫、产气荚膜梭菌——直接监测抗性病原体）——"以指示菌筛检污染风险、以特定病原体监测抗性风险"是饮用水微生物安全多屏障检验的设计逻辑（GB 5749对各级指标分别规定限值）。
"培养法+免疫磁分离法"两类方法体系。 微生物指标检验分两大类方法：培养法（基于微生物在培养基上生长——平皿计数法数菌落总数、多管发酵法查MPN表、滤膜法直接计数菌落、酶底物法底物显色/荧光一步定量——培养法成本低适合常规监测）；免疫磁分离-免疫荧光法（基于抗原抗体特异性识别——磁微粒抗体捕获包囊卵囊、荧光抗体染色显微镜鉴定——用于“两虫”这类不能用培养法检测的病原体（隐孢子虫和贾第鞭毛虫体外培养困难，必须用免疫学方法）——"培养法管细菌、免疫学方法管原虫"的方法分工。
"磁微粒捕获+荧光染色“的免疫磁分离原理。 ”两虫"检验的核心技术是免疫磁分离（IMS）：抗隐孢子虫单抗磁微粒和抗贾第鞭毛虫单抗磁微粒与样品中的卵囊/包囊特异性结合（抗体-抗原免疫反应），在外加磁场作用下磁微粒连同目标病原体被分离富集（从大量杂质中提纯目标——灵敏度提高），再以异硫氰酸盐荧光素标记的单抗进行免疫荧光染色，荧光显微镜下根据形态（大小、形状）和荧光特征鉴定计数——"免疫捕获（专一性）+磁分离（富集）+荧光鉴定（确认）"三步实现低浓度原虫的检出，替代了传统蔗糖漂浮法的低效。
"阳阴性菌株对照+试验无效重测“的微生物质控。 微生物检验的质量控制围绕”培养基和试剂的有效性"：培养基批次更换时必须用阳性菌株（标准菌株产气荚膜梭状芽孢杆菌）和阴性菌株（生孢梭菌）检验（阳性应产生黑色菌落、阴性不应产生——验证培养基支持目标菌生长且选择性正确）；定期阴阳对照试验，对照结果不符合则本批次试验结果无效、查明原因后重新测定——"对照不合格全批次无效"的刚性规定防止假阴性（培养基失效导致漏检），是微生物检验结果可信的底线控制。

适用读者

本文件适用于疾病预防控制中心和卫生检验机构（饮水微生物检验），自来水公司和供水单位水质检测实验室，环境监测机构（水源水微生物监测），饮水消毒和水处理运行管理人员，以及高校公共卫生、卫生检验、微生物学专业师生。

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